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武漢科斯坦生物科技有限公司
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SARS-CoV-2(2019-nCoV) Surrogate Virus Neutralization檢測試劑盒
產品概述(Summary)
產品名稱(Product name)
SARS-CoV-2(2019-nCoV) Surrogate Virus Neutralization檢測試劑盒
本試劑盒基于中和 ELISA 分析技術,將 RBD 蛋白預先包被在酶標板上,之后將陽性對照、陰性對照、分析樣本分別加入到微孔中反應,再加入HRP標記的ACE2蛋白,樣本中的RBD中和抗體會阻斷RBD和ACE2之間的相互作用,清洗掉未結合的試劑,將顯色底物溶液添加到微孔中顯色,顯色強度與樣本中的RBD中和抗體濃度成反比。
用于測定血清和血漿樣本 RBD 中和抗體的含量。
試劑盒按推薦溫度保存6個月,信號強度降低小于 10%。
所需設備及試劑
• 450 nm濾光片酶標儀,含540 nm或570nm校正波長更佳
•單道或多道微量移液器,移液器槍頭
•去離子水
• 500 mL量筒
•樣品稀釋管或不同規格EP管
•吸水紙
•微孔板振蕩儀(可選)
一、樣品收集與儲存
處理所有的血液和血清,請按照NCCLS提供的處理和儲存血清和血漿樣本的建議(1990年H18-A批準的血液樣本處理和處理標準程序)。
血清: 全血室溫放置60分鐘或4℃過夜,然后1000 x g離心15分鐘,取上清檢測,或分裝后于≤-20℃冰箱保存,避免樣品反復凍融。
血漿:使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝劑收集血漿,樣品采集后30分鐘內1000 x g離心15分鐘,取上清檢測,或分裝后于≤-20℃冰箱保存,避免樣品反復凍融。
二、試劑準備
使用前將所有試劑和樣本置于室溫平衡。
1.20×濃縮清洗液:如果濃縮清洗液中有晶體析出,平衡至室溫并搖勻,直到晶體完全溶解,25mL濃縮清洗液使用去離子水定容至500mL,得到清洗工作液。
2.血清、血漿樣本:推薦血清,血漿使用樣本稀釋液 1:9稀釋后上樣,例如10μL樣本加入90μL樣本稀釋液。如果樣本檢測值超出檢測范圍,可適當調整稀釋倍數并重新測定,或預估樣本中抗體濃度,在實驗之前預先稀釋數個梯度同時進行測定。
3.陽性對照工作液:陽性對照臨用前震蕩混勻后用掌上離心機瞬時離心,使液體集中于管底,使用樣本稀釋液1:100稀釋至工作濃度。
4.陰性對照工作液:陰性對照臨用前震蕩混勻后用掌上離心機瞬時離心,使液體集中于管底,使用樣本稀釋液1:10稀釋至工作濃度。
5.檢測溶液A工作液:檢測溶液A臨用前震蕩混勻后用掌上離心機瞬時離心,使液體集中于管底,使用檢測溶液稀釋液1:2000稀釋至工作濃度。
6.顯色液:避光保存,顯色時100μL /孔。
7.終止液:顯色完畢后50μL /孔。
三、實驗步驟
使用前將所有試劑和樣本置于室溫,建議對所有陽性對照、陰性對照和待測樣本進行一式兩份的分析。
1. 按照前面章節的指示準備所有試劑和樣本。
2. 從板架上取下多余的微孔板條,將其放回裝有干燥劑包的鋁箔袋中,然后重新密封保存于-20℃。
3. 每孔分別加入50µL稀釋好的陽性對照工作液,陰性對照工作液和待測樣本,用封板膜蓋好,37℃孵育30分鐘。
4. 每孔分別加入50μL稀釋好的檢測溶液A工作液,用封板膜封住,使用微孔板振蕩儀或手動輕微震蕩5分鐘后,37℃孵育1小時。
5. 棄去孔內液體,每孔加入 300μL的清洗工作液,輕微震蕩后棄去孔內液體,將酶標板倒扣在吸水紙上輕拍,使殘留在孔內的液體全部去除,重復洗板5次,此過程也可采用尖嘴噴射瓶,多道移液器或自動洗板機來完成。
6. 每孔加入100μL顯色液,37℃避光顯色8-10分鐘。
7. 每孔加入50μL終止液,孔里的顏色應該由藍色變至黃色,如果孔內顏色為綠色或顏色變化不均勻,輕輕震動酶標板使顏色均一。
8. 擦干酶標板底部水氣,立刻用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的O.D.值,如果波長校正可用,則設置為540 nm或570 nm,如果波長校正不可用,則從450 nm的讀數中減去540 nm或570 nm的讀數,這種修正可去除酶標板讀數中的光學偏差,如果沒有校正波長,可直接讀取450 nm的讀數,但讀值有可能不準確。
四、結果判讀
為確保結果的有效性,陽性對照和陰性對照檢測O.D.必須在下表所列的范圍內,如果O.D.不符合下表要求,則實驗無效,須重新進行測試。
項目 |
O.D. |
結果判斷 |
陽性對照 |
< 0.3 |
通過 |
陰性對照 |
>0.9 |
通過 |
取每個陽性對照、陰性對照、待測樣本的復孔平均值 O.D.,然后計算抑制率,抑制率計算公式如下:
五、判定閾值
項目 |
閾值 |
結果 |
檢測結果判讀 |
中和抗體檢測 |
≥20% |
陽性 |
檢測到中和抗體 |
<20% |
陰性 |
未檢測到中和抗體 |
六、精密度
批內差:CV<8%
批間差:CV<10%
七、穩定性
試劑盒按推薦溫度保存6個月,信號強度降低小于 10%。
八、實驗細節說明
1. 在試劑盒標簽上的有效期內使用,不要與其他廠家的試劑盒混合使用。
2. 如果樣本檢測值超出檢測范圍,可適當調整稀釋倍數并重新測定,或預估樣本中RBD抗體濃度,在實驗之前預先稀釋數個梯度同時進行測定。
3. 為避免交叉污染,不同標準品、樣本、試劑的加樣需更換移液槍頭,每管試劑使用單獨的容器儲存。
4. 在孵育過程中貼緊封板膜。
5. 顯色液避光保存,臨用前15分鐘從冰箱取出室溫平衡。
6. 濃縮清洗液(20×)需使用去離子水1:20稀釋至工作濃度,去離子水不包含在試劑盒中,需實驗人員自備。
7. 終止液為酸性溶液,具有輕微腐蝕性,使用時避免接觸皮膚、眼、耳、口等暴露部位,如不慎接觸,使用大量清水沖洗后觀察接觸部位反應,如情節嚴重請及時就醫。
8. 試劑盒酶標板條可按需拆卸使用,已開封的試劑盒建議在1個月內使用,未開封的試劑盒所有試劑均按樣品清單中推薦儲存條件保存,收到試劑盒后請將陽性對照、陰性對照、檢測溶液A以及預包板保存于-20℃,其余試劑請置于 4 ℃保存備用。
九、常見問題解決指南
問題 |
原因 |
解決方案 |
標準曲線差 |
移液不精確 |
檢查和校正移液器 |
標準品準備不正確 |
進行正確的標準品梯度稀釋 |
|
O.D 值低 |
孵育時間太短 |
保證充足的孵育時間 |
溫度不正確 |
試劑平衡至室溫并保證孵育溫度正確 |
|
試劑體積不正確 |
檢查移液器并確保加樣體積與說明書一致 |
|
精密度低 |
移液不精確 |
檢查和校正移液器 |
混勻不充分 |
充分混勻和吸取試劑 |
|
洗滌不充分 |
按說明書要求充分洗滌和浸泡 |
|
背景值高 |
洗滌不充分 |
按說明書要求充分洗滌和浸泡 |
清洗液污染 |
重新配置清洗液 |
|
靈敏度低 |
試劑盒儲存不當 |
試劑盒短期整體保存于4℃,長期保存根據說明書分開保存各組分 |
樣品清單及儲存條件
樣品名稱 |
規格 |
描述 |
推薦儲存條件 |
預包板 |
1 板 |
96孔聚苯乙烯微孔板(12列*8孔),預包被RBD 蛋白。 |
密封狀態放置于-20℃保存。 |
陽性對照 |
1 管 |
12μL陽性對照,臨用前用樣本稀釋液1:100 稀釋至工作濃度。 |
放置于-20℃保存。 |
陰性對照 |
1 管 |
60μL陰性對照,臨用前用樣本稀釋液1:10 稀至工作濃度。 |
放置于-20℃保存。 |
檢測溶液A |
1 管 |
12μL HRP標記 ACE2 蛋白(含防腐劑),臨用前用檢測溶液稀釋液1:2000稀釋至工作濃度。 |
放置于-20℃保存。 |
樣本稀釋液 |
1 瓶 |
25 mL稀釋液(含防腐劑),用于陽性對照、陰性對照、血清、血漿的稀釋。 |
放置于4℃保存。 |
檢測溶液稀釋液 |
1 瓶 |
25 mL稀釋液(含防腐劑),用于檢測溶液A的稀釋。 |
放置于4℃保存。 |
濃縮清洗液 |
1 瓶 |
25 mL (20×)濃縮清洗液(含防腐劑),臨用前用去離子水1:20稀釋至工作濃度。 |
放置于4℃保存。 |
顯色液 |
1 瓶 |
12 mL TMB(四甲基聯苯胺)。 |
放置于4℃保存。 |
終止液 |
1 瓶 |
6 mL 2M 酸液。 |
放置于4℃保存。 |
封板膜 |
4 片 |
用于實驗中封閉酶標板。 |
放置于常溫保存。 |
Note
For research use only .