SARS-CoV-2(2019-nCoV) Surrogate Virus Neutralization檢測試劑盒

本試劑盒基于中和 ELISA 分析技術，將 RBD 蛋白預先包被在酶標板上，之后將陽性對照、陰性對照、分析樣本分別加入到微孔中反應，再加入HRP標記的ACE2蛋白，樣本中的RBD中和抗體會阻斷RBD和ACE2之間的相互作用，清洗掉未結合的試劑，將顯色底物溶液添加到微孔中顯色，顯色強度與樣本中的RBD中和抗體濃度成反比。

用于測定血清和血漿樣本 RBD 中和抗體的含量。

所需設備及試劑

• 450 nm濾光片酶標儀，含540 nm或570nm校正波長更佳

•單道或多道微量移液器，移液器槍頭

•去離子水

• 500 mL量筒

•樣品稀釋管或不同規格EP管

•吸水紙

•微孔板振蕩儀（可選）

一、樣品收集與儲存

處理所有的血液和血清，請按照NCCLS提供的處理和儲存血清和血漿樣本的建議（1990年H18-A批準的血液樣本處理和處理標準程序）。

血清： 全血室溫放置60分鐘或4℃過夜，然后1000 x g離心15分鐘，取上清檢測，或分裝后于≤-20℃冰箱保存，避免樣品反復凍融。

血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝劑收集血漿，樣品采集后30分鐘內1000 x g離心15分鐘，取上清檢測，或分裝后于≤-20℃冰箱保存，避免樣品反復凍融。

二、試劑準備

使用前將所有試劑和樣本置于室溫平衡。

1.20×濃縮清洗液：如果濃縮清洗液中有晶體析出，平衡至室溫并搖勻，直到晶體完全溶解，25mL濃縮清洗液使用去離子水定容至500mL，得到清洗工作液。

2.血清、血漿樣本：推薦血清，血漿使用樣本稀釋液 1:9稀釋后上樣，例如10μL樣本加入90μL樣本稀釋液。如果樣本檢測值超出檢測范圍，可適當調整稀釋倍數并重新測定，或預估樣本中抗體濃度，在實驗之前預先稀釋數個梯度同時進行測定。

3.陽性對照工作液：陽性對照臨用前震蕩混勻后用掌上離心機瞬時離心，使液體集中于管底，使用樣本稀釋液1:100稀釋至工作濃度。

4.陰性對照工作液：陰性對照臨用前震蕩混勻后用掌上離心機瞬時離心，使液體集中于管底，使用樣本稀釋液1:10稀釋至工作濃度。

5.檢測溶液A工作液：檢測溶液A臨用前震蕩混勻后用掌上離心機瞬時離心，使液體集中于管底，使用檢測溶液稀釋液1:2000稀釋至工作濃度。

6.顯色液：避光保存，顯色時100μL /孔。

7.終止液：顯色完畢后50μL /孔。

三、實驗步驟

使用前將所有試劑和樣本置于室溫，建議對所有陽性對照、陰性對照和待測樣本進行一式兩份的分析。

1. 按照前面章節的指示準備所有試劑和樣本。

2. 從板架上取下多余的微孔板條，將其放回裝有干燥劑包的鋁箔袋中，然后重新密封保存于-20℃。

3. 每孔分別加入50µL稀釋好的陽性對照工作液，陰性對照工作液和待測樣本，用封板膜蓋好，37℃孵育30分鐘。

4. 每孔分別加入50μL稀釋好的檢測溶液A工作液，用封板膜封住，使用微孔板振蕩儀或手動輕微震蕩5分鐘后，37℃孵育1小時。

5. 棄去孔內液體，每孔加入 300μL的清洗工作液，輕微震蕩后棄去孔內液體，將酶標板倒扣在吸水紙上輕拍，使殘留在孔內的液體全部去除，重復洗板5次，此過程也可采用尖嘴噴射瓶，多道移液器或自動洗板機來完成。

6. 每孔加入100μL顯色液，37℃避光顯色8-10分鐘。

7. 每孔加入50μL終止液，孔里的顏色應該由藍色變至黃色，如果孔內顏色為綠色或顏色變化不均勻，輕輕震動酶標板使顏色均一。

8. 擦干酶標板底部水氣，立刻用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的O.D.值，如果波長校正可用，則設置為540 nm或570 nm，如果波長校正不可用，則從450 nm的讀數中減去540 nm或570 nm的讀數，這種修正可去除酶標板讀數中的光學偏差，如果沒有校正波長，可直接讀取450 nm的讀數，但讀值有可能不準確。

四、結果判讀

為確保結果的有效性，陽性對照和陰性對照檢測O.D.必須在下表所列的范圍內，如果O.D.不符合下表要求，則實驗無效，須重新進行測試。

取每個陽性對照、陰性對照、待測樣本的復孔平均值 O.D.，然后計算抑制率，抑制率計算公式如下：

五、判定閾值

六、精密度

批內差：CV<8%

批間差：CV<10%

七、穩定性

試劑盒按推薦溫度保存6個月，信號強度降低小于 10%。

八、實驗細節說明

1. 在試劑盒標簽上的有效期內使用，不要與其他廠家的試劑盒混合使用。

2. 如果樣本檢測值超出檢測范圍，可適當調整稀釋倍數并重新測定，或預估樣本中RBD抗體濃度，在實驗之前預先稀釋數個梯度同時進行測定。

3. 為避免交叉污染，不同標準品、樣本、試劑的加樣需更換移液槍頭，每管試劑使用單獨的容器儲存。

4. 在孵育過程中貼緊封板膜。

5. 顯色液避光保存，臨用前15分鐘從冰箱取出室溫平衡。

6. 濃縮清洗液（20×）需使用去離子水1：20稀釋至工作濃度，去離子水不包含在試劑盒中，需實驗人員自備。

7. 終止液為酸性溶液，具有輕微腐蝕性，使用時避免接觸皮膚、眼、耳、口等暴露部位，如不慎接觸，使用大量清水沖洗后觀察接觸部位反應，如情節嚴重請及時就醫。

8. 試劑盒酶標板條可按需拆卸使用，已開封的試劑盒建議在1個月內使用，未開封的試劑盒所有試劑均按樣品清單中推薦儲存條件保存，收到試劑盒后請將陽性對照、陰性對照、檢測溶液A以及預包板保存于-20℃，其余試劑請置于 4 ℃保存備用。

九、常見問題解決指南

樣品清單及儲存條件

Note

For research use only .