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產品名稱:

無縫克隆試劑盒

NO.
004
貨號:
CSO00037
中文名稱
無縫克隆試劑盒
英文名詞
/
CAS號
/
產品貨號:
CSO00037
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現貨
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2800.00
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產品信息
如何訂購

概述(Summary)icon
產品中文名
無縫克隆試劑盒
產品描述(Description)
1.產品介紹

無縫克隆是一種新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技術,可以同時將多個DNA片段克隆到任何載體中,并且最終構建的克隆沒有任何額外的堿基序列,因此被稱作“無縫克隆”。
和傳統的基因克隆方法相比,本試劑盒的無縫克隆技術有多方面的優勢:(1)操作更簡單,只需要一次反應即可完成;(2)對酶切位點無要求,可以把目的片段插入到任意載體的任意位點;(3)連接片段之間不會引入任何多余的序列,是真正的無縫克??;(4)陽性克隆率高,降低克隆篩選的工作量。
本試劑盒操作簡單,僅需將載體在插入位點進行線性化,同時將目的片段兩端引物與載體插入位點同源的15-25bp序列,將線性化的克隆載體和帶有同源序列的PCR片段按合適比例混合,并加入2×Master Mix,在重組酶的催化下,50℃反應30min即可快速完成定向克隆,陽性率高達90%以上。試劑盒中2×Master Mix預混了DNA外切酶、DNA聚合酶、連接酶和重組反應所需緩沖液,并添加了特殊的酶激活組分,可顯著提高重組克隆效率,可以一次實現多至3-6個片段的順序拼接克隆。

 2.試劑盒原理示意圖


 2.試劑盒原理示意圖

 

 

 

圖1. 無縫克隆試劑盒原理示意圖 。 單酶切/雙酶切獲得線性化載體。擴增與載體帶有同源臂的目的片段(藍色和紅色部分為同源部分)。按一定的比例將二者混合在2×Master Mix預混液中,50℃反應30min后直接轉化E.coli即可。


產品優勢(Advantage)
和傳統的基因克隆方法相比,本試劑盒的無縫克隆技術有多方面的優勢:
(1)操作更簡單,只需要一次反應即可完成;
(2)對酶切位點無要求,可以把目的片段插入到任意載體的任意位點;
(3)連接片段之間不會引入任何多余的序列,是真正的無縫克??;
(4)陽性克隆率高,降低克隆篩選的工作量。
儲存條件(Storage)
于-20℃避光保存12個月,避免反復凍融。
運輸方式(Shipping)
干冰運輸。
Note
For research use only .
使用方法(Standard Operating Procedure)icon
1.線性化載體的制備

線性化載體制備的兩種方法:(1)在目標載體質粒上選取合適的位點,進行單酶切或者雙酶切,酶切后割膠純化;(2)反向PCR擴增載體,在線性化位點設計一對互補的引物,進行擴增。

2.線性化載體制備的兩種方法

注意:載體質粒單酶切容易造成載體切割不完全和載體自連,導致假陽性的產生,所以盡可能的選擇雙酶切。請務必割膠回收線性化的載體,否則殘余的環狀質粒會產生背景菌落。一般回收后的線性化載體濃度需要>15ng/µl。

2. 目的基因片段的制備

設計引物進行目的片段的擴增:

(1)PCR引物必須包含兩個部分,引物的5"端必須包含與載體末端完全同源的15-25bp堿基,引物的3’端必須包含靶基因特意引物序列。

(2)每條引物的3’端必須具有目的基因特異性,長度為15-25bp,GC%為40%-60%,退火溫度Tm為58℃-65℃。PCR產物經跑膠,割膠純化待用。

(3)當有多個片段插入時,首片段和末尾片段引物的5"端必須包含與載體末端完全同源的15-25bp堿基。其余中間片段引物的5"端必須包含與前一個片段15bp左右同源序列,3"端必須包含與后一個片段15bp左右同源序列。

3.反應體系的設置

參考下表在冰上配制重組反應體系:

2 ×Master Mix

5 µl

Linearized vector

50-200ng

Purified PCR Fragment

20-200ng

Total

10 µl

反應條件:插入單個片段,一般需50℃反應30min;隨著插入片段的增多,長度的加大,反應時間隨之延長,一般需要45-60min。

注意:線性化載體與目的片段的加入量可以根據各自的濃度,片段的長度自行調整。目的片段與線性化載體的摩爾比在3:1左右,過高或過低都會降低重組效率。

 

4.轉化及陽性克隆的鑒定

(1)取100μl待轉化感受態,置于冰上解凍。

(2)向上述感受態細胞懸浮液中加入10μl重組好的反應液(按第3步操作),輕輕混勻,不能震蕩,將該混合物置于冰上30 min。

(3)在42℃的水浴中熱激90 sec,立即置于冰上保存2 min,再加入500 μl LB培養基(不含抗性),37 ℃搖床200rpm震蕩培養1h左右。

(4)取上述轉化混合液200-300μl,涂布在選擇性固體培養基上(含相應抗生素),待菌液被培養基充分吸收后,將平板倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養過夜。

(5)挑平板上的克隆進行菌落PCR,或提質粒雙酶切鑒定陽性克隆。

組分&說明(Component & Instruction)icon

樣品名稱

規格

描述

推薦儲存條件

預包板

96孔聚苯乙烯微孔板(12*8孔),預包被RBD     蛋白。

密封狀態放置于-20℃保存。

陽性對照

12μL陽性對照,臨用前用樣本稀釋液1:100 稀釋至工作濃度。

放置于-20℃保存。

陰性對照

60μL陰性對照,臨用前用樣本稀釋液1:10 稀至工作濃度。

放置于-20℃保存。

檢測溶液A

12μL HRP標記 ACE2 蛋白(含防腐劑),臨用前用檢測溶液稀釋液1:2000稀釋至工作濃度。

放置于-20℃保存。

樣本稀釋液

25 mL稀釋液(含防腐劑),用于陽性對照、陰性對照、血清、血漿的稀釋。

放置于4℃保存。

檢測溶液稀釋液

25 mL稀釋液(含防腐劑),用于檢測溶液A的稀釋。

放置于4℃保存。

濃縮清洗液

25 mL 20×)濃縮清洗液(含防腐劑),臨用前用去離子水1:20稀釋至工作濃度。

放置于4℃保存。

顯色液

12 mL TMB(四甲基聯苯胺)。

放置于4℃保存。

終止液

6 mL 2M 酸液。

放置于4℃保存。

封板膜

用于實驗中封閉酶標板。

放置于常溫保存。

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