溶液內蛋白質鑒定

　?。?）背景介紹

　　溶液內蛋白質鑒定的基本流程與膠內蛋白質鑒定類似，主要區別在于：（1）溶液內蛋白質樣品處理方法有別于膠內樣品；（2）溶液內蛋白成分較單一蛋白條帶相對復雜，需采用較長的梯度進行質譜數據采集。

　　根據項目的不同，樣品可能是復雜的全細胞裂解液，或者IP的洗脫液，或者蛋白純化產物，通過質譜檢測，可以得到樣品中蛋白成分的鑒定結果，并可根據特定需求，提供相對定量參考或蛋白功能注釋等分析。

 

　?。?）實驗流程

 

 

　?。?）案例分析

　　a.目的

　　鑒定與靶標蛋白DDX58相互作用的蛋白質。為了實現這一目標，選取兩種細胞系（一種為穩定表達帶HA標簽DDX58蛋白的293細胞系，命名為實驗組T；另一種為常規293細胞系，命名為對照組C），用HA抗體分別免疫共沉淀實驗組T及對照組C，收集蛋白洗脫液，溶液內酶解后，通過質譜分析，排除非特異性結合蛋白，最終篩選出與DDX58相互作用的蛋白。

 

　　b.步驟

　　1）免疫共沉淀純化靶標蛋白及相互作用蛋白；

　　2）從洗脫液中進行蛋白提??；

　　3）溶液內蛋白酶解；

　　4）質譜檢測；

　　5）數據庫檢索并鑒定蛋白。

 

　　c.結果

　　在實驗組T和對照組C中鑒定到的蛋白可以分為兩大類：一類是在T組含量比在C組多的蛋白，另一類則是含量相當或在C組更多的蛋白。根據實驗目的，需要關注的蛋白是第一類，作為互作的候選蛋白。部分鑒定結果如下表所示，靶標蛋白DDX58只在實驗組T中被檢測到，ACTN4、SFPQ、SND1則可能是DDX58的相互作用蛋白?；诘鞍踪|豐度越高，采集到的二級譜圖數越多的原則，我們采用譜圖計數方法進行蛋白含量相對比較，結果見下表：

 

　　質譜鑒定蛋白列表