?。?)背景介紹
溶液內蛋白質鑒定的基本流程與膠內蛋白質鑒定類似,主要區別在于:(1)溶液內蛋白質樣品處理方法有別于膠內樣品;(2)溶液內蛋白成分較單一蛋白條帶相對復雜,需采用較長的梯度進行質譜數據采集。
根據項目的不同,樣品可能是復雜的全細胞裂解液,或者IP的洗脫液,或者蛋白純化產物,通過質譜檢測,可以得到樣品中蛋白成分的鑒定結果,并可根據特定需求,提供相對定量參考或蛋白功能注釋等分析。
?。?)實驗流程

?。?)案例分析
a.目的
鑒定與靶標蛋白DDX58相互作用的蛋白質。為了實現這一目標,選取兩種細胞系(一種為穩定表達帶HA標簽DDX58蛋白的293細胞系,命名為實驗組T;另一種為常規293細胞系,命名為對照組C),用HA抗體分別免疫共沉淀實驗組T及對照組C,收集蛋白洗脫液,溶液內酶解后,通過質譜分析,排除非特異性結合蛋白,最終篩選出與DDX58相互作用的蛋白。
b.步驟
1)免疫共沉淀純化靶標蛋白及相互作用蛋白;
2)從洗脫液中進行蛋白提??;
3)溶液內蛋白酶解;
4)質譜檢測;
5)數據庫檢索并鑒定蛋白。
c.結果
在實驗組T和對照組C中鑒定到的蛋白可以分為兩大類:一類是在T組含量比在C組多的蛋白,另一類則是含量相當或在C組更多的蛋白。根據實驗目的,需要關注的蛋白是第一類,作為互作的候選蛋白。部分鑒定結果如下表所示,靶標蛋白DDX58只在實驗組T中被檢測到,ACTN4、SFPQ、SND1則可能是DDX58的相互作用蛋白?;诘鞍踪|豐度越高,采集到的二級譜圖數越多的原則,我們采用譜圖計數方法進行蛋白含量相對比較,結果見下表:
質譜鑒定蛋白列表
#
|
Accession
|
Name
|
MS2 count (T)
|
MS2 count (C)
|
1
|
O95786
|
DDX58
|
85
|
0
|
2
|
P13639
|
EF2
|
52
|
51
|
3
|
Q00839
|
HNRPU
|
44
|
40
|
4
|
P11586
|
C1TC
|
39
|
43
|
5
|
P08238
|
HS90B
|
33
|
31
|
6
|
P14625
|
ENPL
|
29
|
21
|
7
|
Q8WUM4
|
PDC6I
|
25
|
27
|
8
|
O43707
|
ACTN4
|
22
|
0
|
9
|
P23246
|
SFPQ
|
23
|
3
|
10
|
Q7KZF4
|
SND1
|
18
|
1
|
11
|
Q9BUJ2
|
HNRL1
|
2
|
3
|
12
|
P35527
|
K1C9
|
0
|
2
|
?。?)參考文獻
● A Chemical Proteomics Approach to Profiling the ATP-binding Proteome of Mycobacterium tuberculosis. Molecular & Cellular Proteomics 2013.
● Systematic Analysis of Human Protein Complexes Identifies Chromosome Segregation Proteins. Science 2010.