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蛋白質組學

溶液內蛋白質鑒定

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 ?。?)背景介紹
  溶液內蛋白質鑒定的基本流程與膠內蛋白質鑒定類似,主要區別在于:(1)溶液內蛋白質樣品處理方法有別于膠內樣品;(2)溶液內蛋白成分較單一蛋白條帶相對復雜,需采用較長的梯度進行質譜數據采集。
  根據項目的不同,樣品可能是復雜的全細胞裂解液,或者IP的洗脫液,或者蛋白純化產物,通過質譜檢測,可以得到樣品中蛋白成分的鑒定結果,并可根據特定需求,提供相對定量參考或蛋白功能注釋等分析。
 
 ?。?)實驗流程
 
 
 ?。?)案例分析
  a.目的
  鑒定與靶標蛋白DDX58相互作用的蛋白質。為了實現這一目標,選取兩種細胞系(一種為穩定表達帶HA標簽DDX58蛋白的293細胞系,命名為實驗組T;另一種為常規293細胞系,命名為對照組C),用HA抗體分別免疫共沉淀實驗組T及對照組C,收集蛋白洗脫液,溶液內酶解后,通過質譜分析,排除非特異性結合蛋白,最終篩選出與DDX58相互作用的蛋白。
 
  b.步驟
  1)免疫共沉淀純化靶標蛋白及相互作用蛋白;
  2)從洗脫液中進行蛋白提??;
  3)溶液內蛋白酶解;
  4)質譜檢測;
  5)數據庫檢索并鑒定蛋白。
 
  c.結果
  在實驗組T和對照組C中鑒定到的蛋白可以分為兩大類:一類是在T組含量比在C組多的蛋白,另一類則是含量相當或在C組更多的蛋白。根據實驗目的,需要關注的蛋白是第一類,作為互作的候選蛋白。部分鑒定結果如下表所示,靶標蛋白DDX58只在實驗組T中被檢測到,ACTN4、SFPQ、SND1則可能是DDX58的相互作用蛋白?;诘鞍踪|豐度越高,采集到的二級譜圖數越多的原則,我們采用譜圖計數方法進行蛋白含量相對比較,結果見下表:
 
  質譜鑒定蛋白列表
 
#
Accession
Name
MS2 count (T)
MS2 count (C)
1
O95786
DDX58
85
0
2
P13639
EF2
52
51
3
Q00839
HNRPU
44
40
4
P11586
C1TC
39
43
5
P08238
HS90B
33
31
6
P14625
ENPL
29
21
7
Q8WUM4
PDC6I
25
27
8
O43707
ACTN4
22
0
9
P23246
SFPQ
23
3
10
Q7KZF4
SND1
18
1
11
Q9BUJ2
HNRL1
2
3
12
P35527
K1C9
0
2
 
 ?。?)參考文獻
  ● A Chemical Proteomics Approach to Profiling the ATP-binding Proteome of Mycobacterium tuberculosis. Molecular & Cellular Proteomics 2013.
 
  ● Systematic Analysis of Human Protein Complexes Identifies Chromosome Segregation Proteins. Science 2010.
 
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